轉(zhuǎn)染腺病毒：大概用50-100 μl/瓶(75 cm2)，加入病毒前換培養(yǎng)液，之后不用換液，直到3 d左右收集病毒，效果比較好。
培養(yǎng)293細(xì)胞應(yīng)注意以下幾個方面：
1.用1640加10%胎牛血清，有的種系用DMEM.血清要求質(zhì)量較高，在普通血清中細(xì)胞生長不太好。1640用雙蒸水溶解，按說明加入碳酸氫鈉。
2.培養(yǎng)液中應(yīng)加入HEPES，起緩沖pH值的作用，否則會影響細(xì)胞狀態(tài)。如果用20%的HEPES，每次配培養(yǎng)液時每200ml培養(yǎng)液可加入5ml.加入HEPES后1640培養(yǎng)液顏色略呈橘黃色而非暗紅色。
3.消化所用胰酶可選擇0.125%濃度，且不要消化時間太長。也有研究者認(rèn)為不用胰酶，直接吹打使細(xì)胞脫壁，但使用胰酶效果較好。消化時在鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)稍有變化即可，不要等形態(tài)明顯變化后再停止。可以不用加血清終止消化，只要將胰酶倒出來，加上培養(yǎng)液吹打即可。
4.傳代密度不宜過高也不易過低，一般1瓶傳3瓶可能比較合適。
5.培養(yǎng)液應(yīng)該適當(dāng)偏酸性，在7.0-7.2之間比較好。一般加上HEPES后，pH值是不用調(diào)的。
6.細(xì)胞代數(shù)越高生長越快，同時性狀和原代差別也更大。一般2-3天傳代一次比較合適。
7.傳代時細(xì)胞密度在80%左右比較好，如果超過90%融合再傳會影響細(xì)胞狀態(tài)。
293細(xì)胞培養(yǎng)
293細(xì)胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5 E1區(qū)的人胚腎亞三倍體細(xì)胞系，是一種E1區(qū)缺陷互補細(xì)胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。293細(xì)胞是貼壁依賴型呈上皮樣細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型，細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種：貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)。這三種方式均可用于293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。293細(xì)胞在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養(yǎng)基中。單層培養(yǎng)細(xì)胞在5-10％FBS-DMEM中能生長很好。一般來講，1:10傳代后，一周可以長滿。嚴(yán)禁過度生長，這點很重要。因為會導(dǎo)致細(xì)胞密度加大和堆積，影響病毒斑的形成和轉(zhuǎn)染，傳代時也不易打散。懸浮的293細(xì)胞很容易大規(guī)模培養(yǎng)，但不容易長期保持穩(wěn)定。293細(xì)胞在傳代120次以后，其表型可能改變，生長狀況不再完全是單層的了，偶爾會形成局部的細(xì)胞成團聚集，應(yīng)立即拋棄，重新引入新傳代的細(xì)胞。
293細(xì)胞培養(yǎng)特性：
1、293細(xì)胞明顯適應(yīng)酸性環(huán)境,pH值在6.9～7.1時,可順利貼壁生長, 換液時動作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基。
2、傳代：倒去廢液，PBS洗一次（輕），用0.02%EDTA與0.25%Trypsin消化，生長良好細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中輕搖,使之流遍所有細(xì)胞表面,即將其吸除或棄去消化30s，然后吸去，再讓剩下的EDTA/Trypsin作用30s,鏡下觀察細(xì)胞變圓,就可加DMEM終止消化，反復(fù)吹打**細(xì)胞全成單個懸浮細(xì)胞即可。12小時-24小時90%以上細(xì)胞貼壁。293細(xì)胞傳代時機為達80-90%匯合，傳代比例為1：3。
3、293細(xì)胞在低代時容易貼壁，生長良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團，且貼壁不牢，用PBS沖洗時即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細(xì)胞懸液，**好購入時先大量凍存。
4、復(fù)蘇　293細(xì)胞的另一生長特性是貼壁所需時間長且貼壁不牢。細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇時,都有不同程度的腫脹,若以50ml培養(yǎng)瓶待細(xì)胞長滿瓶底的70%～80%時消化凍存,復(fù)蘇時將其全部接種**2個50ml瓶中時較為合適。剛復(fù)蘇的293貼壁很慢，復(fù)蘇接種后24小時內(nèi),應(yīng)盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)或不作觀察,以免因晃動而影響細(xì)胞貼壁。復(fù)蘇后48小時左右觀察貼壁情況并進行**更換培養(yǎng)基比較合適,如果用一次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細(xì)胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱。
5、轉(zhuǎn)染：體外應(yīng)用293細(xì)胞進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，如果是采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染，一定要注意293細(xì)胞不要全部長滿細(xì)胞培養(yǎng)盤，長滿細(xì)胞時加入磷酸鈣就會使293細(xì)胞大片的脫落，**好是當(dāng)293生長到1/2或2/3時進行磷酸鈣轉(zhuǎn)染，可以避免細(xì)胞的大量脫落。
 
其它的經(jīng)驗：1、用大瓶培養(yǎng)較小瓶要好，可能是更有利于293均勻的分布，利于營養(yǎng)的攝取
2、培養(yǎng)液要新鮮，每次只配1000ml，分為2-4瓶，不用的培養(yǎng)液，凍存在-20度，
3、要及時傳代，**好是細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底部，但是細(xì)胞之間還沒有完全貼緊，總是多少有空隙的時候**好。
4、如果細(xì)胞貼壁不好，可能是消化過久，或是培養(yǎng)瓶不夠干凈，當(dāng)然要除外細(xì)胞污染。
5、如果使用用玻璃培養(yǎng)瓶或皿，可以采用高壓滅菌的0.2%明膠溶液預(yù)處理培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿，方法是將明膠加入培養(yǎng)皿，使之浸泡到底面的各個部分，然后吸出，置超凈臺內(nèi)晾干即可使用。這樣處理后細(xì)胞貼壁效果好且鏡下細(xì)胞立體感強。如果是新的塑料培養(yǎng)瓶就不用處理。
 
培養(yǎng)基；GIBCO DMEM粉劑，加雙抗，HEPES，NaHCO3 配置高糖的DMEM培養(yǎng)基1000ml，
1.一袋DMEM培養(yǎng)基（GIBCOBRL)用去離子水溶解
2.加入NaHCO3 2.0g
3.加入谷氨酰胺 0.146g（終濃度為5mM）
4.加入青霉素10萬U（終濃度100u/ml），鏈霉素6.5萬U（終濃度100u/ml）
5.定容900ml
6.過濾除菌、分裝到兩個消毒的500ml瓶子中
7.加入滅活小牛血清100ml。
 
實驗器材：293細(xì)胞 Ad-TSHR-289  Ad-β-gal培養(yǎng)瓶 DMEM培養(yǎng)基 胎牛血清 胰酶 HEPES緩沖液 PBS 青鏈雙抗